Ученые из Бостонского университета впервые создали широкомасштабную систему генетических блоков, позволяющую программировать действия человеческих клеток с применением булевой алгебры.
Статья опубликована в Nature Biotechnology.
Система, которую ученые назвали BLADE (Boolean logic and arithmetic through DNA excision), позволяет контролировать внутриклеточные процессы с помощью рекомбиназ. Рекомбиназы — это ферменты, которые умеют разрезать и сшивать нить ДНК и способны работать и как активаторы, и как репрессоры транскрипции. Активация может быть достигнута, например, при вырезании области терминатора транскрипции, расположенного перед интересующим геном (ИГ), или при разворачивании ИГ в правильную сторону относительно промотора. В свою очередь, репрессия может быть достигнута вырезанием самого ИГ или разворачиванием его в неправильную сторону. Вырезать по вышеописанной схеме умеют тирозин-зависимые рекомбиназы, а разворачивать — серин-зависимые. Для них в «текст» ДНК помещают специальные сайты — специфические последовательности из нескольких нуклеотидов по обе стороны от нужного участка, которые рекомбиназы узнают и приступают к работе. Ученые протестировали работу двенадцати рекомбиназ в почечных эмбриональных клетках человека и выбрали две наиболее подходящие — Cre и Flp, которые функционируют совершенно независимо друг от друга.
Возможность по-разному располагать сайты этих двух рекомбиназ относительно последовательности ИГ и его терминатора позволила ученым разработать соответствующие схемы для всех шестнадцати существующих логических значений (булевых операторов), таких как «И» и «ИЛИ», и использовать их для создания логической системы с N вводами (в описанном выше случае N=2, по числу типов рекомбиназ) и M-состояниями. В результате сочетания таких операторов в ДНК можно путем их «включения» и «выключения» добиться сложной регуляции работы генов в клетке. Кроме того, разнообразить работу рекомбиназ позволило использование дополнительных сайтов, слегка мутированных — рекомбиназа зачастую работает таким образом, что узнает только совершенно одинаковые сайты (они могут быть оба мутированными или оба нормальными, но не разными).
Для того, чтобы протестировать работу системы BLADE, исследователи, в том числе, работали с четырьмя генами, кодирующими флуоресцентные белки tagBFP, EGFP, iRFP720 и mRuby2 в клетках лимфоцитов Jurkat T, используя доксициклиновую регуляцию (что позволяло дозировать эффект работы рекомбиназ). Блоки, составленные из операторов, были устроены таким образом, чтобы включать отдельные гены в четырех разных состояниях: при попадании в ядро каждой из рекомбиназ по отдельности, при отсутствии их обеих или при наличии их обеих одновременно. Эксперимент подвердил, что рекомбиназы работают правильным образом, и соответствующие белки светились в клетках даже через две недели после начала эксперимента.
Работа четырех генов, кодирующих разные флуоресцентные белки, в 4 вариантах состояний системы (вверху — до добавления доксициклина, внизу — при достижении его максимальной концентрации).
После этого ученые составили библиотеку из 113 блоков, размерами превышающую все ранее описанные библиотеки подобного типа, и протестировали работу блоков с помощью векторного теста, измеряя угол отклонения реальных результатов работы каждого из блоков от правильного направления согласно «истинной таблице», составленной заранее. Отклонение в 0° подразумевало идеальную работу блока, а угол 90° означал полное несоответствие заданного и полученного направлений. Тест показал, что 106 из 113 блоков отклонялись от заданного направления не более чем на 15%. Ни один блок не отклонился от него более, чем на 25 процентов. Кроме того, более 96 процентов блоков были ближе всего именно к своему идеальному направлению — что является самым высоким результатом среди всех подобных исследований, осуществляемых, главным образом, с кишечными палочками.
После этого были проведены дополнительные эксперименты, показавшие, что работу BLADE можно совмещать с работой CRISPR-Cas9 систем. BLADE не нарушает деятельности CRISPR-Cas9 и может работать с РНК-проводниками (gRNA), снабженными соответствующими сайтами. Кроме того, работу BLADE можно контролировать, например, с помощью лекарственных средств — таких, как 4-гидроксиамоксифен, который будет «отпускать» рекомбиназы, предварительно связанные с мутированным рецептором эстрогена, и позволять им попадать в ядра тогда, когда это бывает нужно.
Это первая система генетических блоков, которая работает со столь высокой эффективностью при таком количестве операторов и протестирована на человеческих, а не на бактериальных клетках. О менее масштабных экспериментах с кишечной палочкой мы уже рассказывали раньше. Ученые полагают, что такие системы можно будет применять для решения самых разнообразных биоинженерных и медицинских задач.